離心機在生物工程固液分離、全發酵液提取等應用
2021-08-30
從古至今，人類都沒有放棄對發酵工程的研究，在現代生物工程技術中它是一種“舊改新”的技術，同時生物分離也是生物產品產業化的必經之路，分離效率直接決定產品的生產成本，因此生物工業下游技術的發展日益受到研究者的重視。
從廣義上講，發酵工程由三部分組成：上游工程，發酵工程和下游工程。其中，下游工程指從發酵液中分離和純化產品的技術：包括固液分離技術（離心分離，過濾分離，沉淀分離等工藝）；細胞破壁技術（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等）；蛋白質純化技術（沉淀法、色譜分離法和超濾法等）。
因而，如何從混合原料中高效、快速、特異捕獲目標物質是下游技術的首要解決問題？本文對其中的固液分離技術的原理、方法和設備做一綜述。
1、目標物在胞內，通過固液分離才可以收集胞內產物的細胞或菌體，除去液相；
2、分離除去細胞碎片、獲得胞內的目標物；
3、目標物在液相，通過固液分離收集含生化物質的液相，除去固體懸浮物，如細胞、菌體、細胞碎片，蛋白質的沉淀物和它們的絮凝體等(比如抗生素等小分子的分離)。
1、傳統的固液分離適用于物理狀態不同的固液混合體；
2、從發酵液中除去菌體細胞；
3、除去細胞裂解后的細胞碎片；
4、沉淀出的蛋白質或其它無機鹽等物質；
5、因而有時需要通過凝聚或絮凝等創設條作加固形物。同時，也降低了粘度；
6、現在基于粒度不同：膜技術、雙水相萃取、擴張床吸附等。
從微生物發酵液或細胞培養液中提取生化物質的重要步驟就是預處理和固液分離。其目的不僅在于分離細胞、菌體和其他懸浮顆粒，還希望除去部分可溶性雜質和改變濾液的性質，以利于后續的各步操作。
對發酵液進行預處理可以促進從懸浮液中分離固形物的速度，提高固液分離的效率：
加熱法：加熱可降低液體的黏度，根據流體力學的原理，濾液通過濾餅的速率與液體的黏度成反比，可見降低液體黏度可有效提高過濾速率；同時，在適當溫度和受熱時間下可使蛋白質凝聚，形成較大顆粒的凝聚物，進一步改善了發酵液的過濾特性。例如，鏈霉素發酵液，調酸至PH3.0后，加熱至70℃，維持半小時，其黏度下降至原來的1/6，過濾速率可增大10～100倍。
調節懸浮液的PH值：PH值直接影響發酵液中某些物質的電離度和電荷性質，因此適當調節發酵液的PH值可改善其過濾特性。此法是發酵工業中發酵液預處理較常用的方法之一。
凝聚和絮凝：凝聚和絮凝都是懸浮液預處理的重要方法，其處理過程就是將化學藥劑預先加入到懸浮液中，改變細胞、細胞碎片、菌體和Pro等膠體粒子的分散狀態，破壞其穩定性，使其凝結成較大的顆粒，便于提高過濾速率，而且能有效地除去雜蛋白和固體雜質，提高濾液質量。但凝聚和絮凝是兩種不同方法，其具體處理過程還是有差別的，應該明確區分開來，不可混淆。
（1）凝聚：指向膠體懸浮液中加入某種電解質，在電解質異電離子作用下，膠體粒子的雙電層電位降低，從而使膠體失去穩定性并使粒子相互凝聚成1mm左右大小的塊狀凝聚體的過程。
▲凝聚示意圖
（2）絮凝：指使用絮凝劑將膠體粒子交聯成網，形成10mm左右大小的絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。采用凝聚方法得到的凝聚體，其顆粒常常只有1mm左右，比較細小，有時還不能有效地進行分離。而采用絮凝方法則常可形成粗大的絮凝體（10mm左右），使發酵液較容易分離。
▲高分子凝聚劑混合、吸附和絮凝示意圖
添加助濾劑：助濾劑是一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。這是因為使用助濾劑后，懸浮液中大量的細微粒子被吸附到助濾劑的表面上，從而改變了濾餅結構，使濾餅的可壓縮性下降，過濾阻力降低。
常用的助濾劑有硅藻土、纖維素、石棉粉、珍珠巖、白土、炭粒和淀粉等。
添加反應劑：通過添加一些不影響目的產物的反應劑，可消除發酵液中某些雜質對過濾的影響，從而提高過濾速率。加入的反應劑與某些可溶性鹽類發生反應，生成不溶性沉淀，如CaSO4、 AlPO4等。
添加草酸鹽除去高價無機離子：主要是Ca2+、Mg2+和Fe2+等。
沉淀法：Pro是兩性物質，在酸性溶液中，能與一些陰離子如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、苦味酸鹽等形成沉淀，在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。
變性法：其中最常用的是加熱法，還有大幅度調節PH，加酒精、丙酮等有機溶劑或一些表面活性劑等方法。
吸附法：加入某些吸附劑吸附雜蛋白而將其除去。
固液分離是生物產品生產中經常遇到的重要單元操作，固液分離可以收集胞內產物的細胞或菌體，分離除去液相；還可以收集含生化物質的液相，分離除去固體懸浮物(細胞、菌體、細胞碎片、蛋白質的沉淀物和它們的絮凝體等)。
因此，培養基、發酵液、某些中間產品和半成品等都需要進行固液分離，其方法很多，傳統的方法是過濾和離心；現代一種全新的生物分離技術被提出，即全發酵液提取，主要用到的方法有膜技術、雙水相萃取、擴張床吸附。
過濾操作是借助于過濾介質，在一定的壓力差△p作用下，使懸浮液中的液體通過介質的孔道，而固體顆粒被截留在介質上，從而實現固液分離的單元操作。
（1）過濾介質
織物介質：又稱濾布，應用最廣泛，包括由棉、麻等天然纖維濾布和合成纖維濾布；
粒子介質：有硅藻土、珍珠巖粉、細砂、活性炭、白土等；
多孔固體介質：如多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料等，可加工成板狀或管狀，孔隙很小且耐腐蝕，常用于過濾含有少量微粒的懸浮液。
（2）常用設備
△按操作方式分類：間歇過濾機、連續過濾機
△按操作壓強差分類：壓濾、吸濾和離心過濾
板框壓濾機（間歇操作）：板框壓濾機的過濾推動力來自泵產生的液壓或進料貯槽中的氣壓。廣泛應用于培養基制備的過濾及霉菌、 放線菌、酵母菌和細菌等多種發酵液的固液分離。
▲板框壓濾機示意圖
▲板框壓濾機結構圖
轉筒真空過濾機(連續操作)：工業上應用最廣的一種連續操作的過濾設備。轉筒真空過濾機可吸濾、洗滌、卸餅、再生連續化操作，生產能力大，勞動強度小。其主要適用霉菌發酵液，對菌體細小、黏度大鋪助濾劑。對于濾餅阻力較大的物料適應能力較差。
▲轉筒真空過濾機實物圖
▲轉筒真空過濾機結構圖
過濾式離心機：離心過濾是指藉旋轉液體所受到的離心力而通過介質和濾餅、固體顆粒被截留于過濾介質表面的操作過程。離心過濾的推動力即離心力。
▲過濾式離心機結構圖
▲過濾式離心機原理圖
對于濃度較小，粒徑較大，硬度較強的不溶物，可以采用過濾分離。但當固體顆粒細小而難以過濾時，發酵液不易被過濾純化，離心操作往顯得十分有效。
離心分離是基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。一般動植物細胞的收集、細胞碎片和沉淀的分離等常用離心分離。
利用離心機高速旋轉產生的離心力來實現分離，具有分離速度快、分離效率高，液相澄清度好等優點；缺點是設備投資高、能耗大，此外，連續排料時，固相干度不如過濾設備。離心機的樣式有：斜角式、平拋式、管式、蝶式、螺旋式、多室式。
▲斜角式離心機圖
▲平拋式離心機圖
▲管式離心機圖
▲蝶式離心機圖
▲螺旋式離心機圖
▲多室式離心機圖
一種新型的生物分離技術概念，集成化分離技術，即對已有的兩種或兩種以上的單元操作進行有效的組合，組成一種有效的單元操作，以達到提高產品收率、縮短純化步驟、降低純化費用和投資成本的目的。
（1）膜技術
采用膜直接吸附法，經一步分離就可達到過濾、濃縮和初步純化的效果。該技術的關鍵在于膜上連接的配基數量要大，同時必須解決膜孔道的污染問題。
（2）雙水相萃取
向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙醇等）后，形成密度不同的兩相，輕相中富含某種高分子化合物，重相中富含鹽類或另種高分子化合物，從而達到分離和提純某種高分子化合物的目的。
（3）擴張床吸附
向細胞碎片懸浮液中加入某種固體吸附劑，或者用細胞碎片懸浮液通過裝有吸附劑的固定床，即可達到除去細胞碎片的目的。主要的問題是很難選擇合適的吸附劑，以保證目的產物不被吸附而損失。
由于擴張床吸附層析技術具有集成化分離的優點，分離周期短，成本低，在生物產品的分離中應用廣泛，特別適用于含有細胞等固體粒子的粗制品的分離。同時擴張床介質的配基主要是離子交換配基、疏水配基以及親和配基，由此，決定了該技術不再局限于蛋白質分離，即擴張床技術的應用領域在日益擴大。
發酵液的分離純化技術，在生物工程產品的下游處理過程中有十分廣闊的應用前景，目前通過我國科研人員不斷研究、消化、吸收國內外同類產品優質技術，我國的固液分離設備在結構形式、分離效率、自動化水平、功能集成、產品質量和可靠性方面已經有了質的飛躍，近年來在各行各業中不斷地被廣泛應用。
隨著科技的不斷發展，無論是固液分離技術還是設備，我國都將快速縮短與歐美發達國家的差距。